兽药内服制剂的微生物污染对食品动物健康及兽药临床疗效的影响研究

高迎春1，张传津¹，徐恩民¹，陆庆泉¹，冯涛¹，李淑花¹，都业良²

(1.山东省兽药质量检验所，山东 济南 250022

2.青岛农业大学，山东 青岛 266109)

微生物污染的监控（微生物限度检查）是兽药质量安全性评价的重要指标，制剂微生物限度检查是兽药安全使用的重要保障。《中国兽药典》二OO五年版一部完全参照相应版本的《中国药典》确定的微生物限度标准^[1-2]。众所周知，动物的用药方式与人的有很大区别。首先，动物大部分的给药方式是群体给药，给药途径多是饮水和拌料。其次，动物的生存环境较人的也有很大的差距，环境中的微生物不可避免的会随饮水、拌料以及动物自身摄取进入动物的体内。同时，根据兽药GMP的要求，兽药不同剂型生产环境控制也不同。因此，如何科学客观地确定兽药微生物限度标准成为了目前兽药药检工作者的主要研究课题之一。

本试验对山东省兽药GMP企业生产的粉散剂、颗粒剂产品的微生物污染状况进行广泛地抽样调查检测，在此基础上，对兽药中实际存在的微生物对动物健康的影响以及兽药被微生物污染后对临床疗效的影响做进一步的研究和探讨，为摸清实际生产中不同剂型兽药的污染水平，制订符合中国国情的兽药微生物限度标准提供一定的参考。

1  兽用内服给药制剂中微生物污染程度调查检测

1.1调查范围

山东省兽药粉剂/散剂/预混剂、颗粒剂车间通过GMP企业中具有代表性的大、中、小型企业各10家2007年下半年至2008年3月生产的相关品种兽药。

1.2抽样时间

2008年3月-5月。

1.3抽样方法及数量

根据兽药管理条例、农业部6号令的抽样规定，从企业仓库随机抽样，共抽查256批，其中粉散剂/预混剂130批（可溶性粉65批、预混剂35批、中药散剂30批）、中药颗粒剂126批。

1.4检测方法

参照《中国兽药典》二OO五年版一部附录中微生物限度检查法。

1.5检测结果

1.3.1中药颗粒剂微生物限度检查结果  126批颗粒剂微生物限度检查结果表明，细菌数平均值：412cfu/g；霉菌和酵母菌数平均值181cfu/g;大肠杆菌阳性检出率67.5%。

1.3.2 粉剂/预混剂微生物限度检查结果  100批粉剂/预混剂检查结果表明，95.4%样品细菌数＜1cfu/g；76.9%的样品霉菌和酵母菌数＜1cfu/g；大肠杆菌阳性检出率4.6%。

1.3.3 中药散剂微生物限度检查结果  30批中药散剂检查结果表明，细菌数平均值：8.57×10⁵cfu/g；霉菌和酵母菌数平均值9.70×10³cfu/g;大肠杆菌阳性检出率100%。

1.6分析讨论

由以上微生物限度检查结果可以看出，不同剂型的兽药制剂虽然同为内服制剂，但微生物污染水平差异较大。影响因素分析如下：

1.4.1各类制剂不同生产环境的影响   同为中药制剂，中药颗粒剂生产环境是在30万级或在10万级生产车间生产的，中药散剂是在一般区域条件下生产的，显然洁净区微生物污染水平明显低于一般区域。

1.4.2药物本身抑菌活性的影响  粉剂、颗粒剂、散剂三个剂型微生物限度检查结果表明，西药粉剂/预混剂这类产品由于大部分药物本身具有较强抑菌或杀菌活性，且有的产品是广谱抗菌素，虽然这类药物是在一般区域生产的（中药颗粒剂生产环境是10万级或30万级），但它不利于微生物增殖生长；而大部分中药本身抗菌活性较差，所以西药粉剂微生物检测结果数值显著低于中药散剂、中药颗粒剂。

1.4.3不同制剂工艺的影响：虽然中药颗粒剂、散剂同为中药制剂，但中药颗粒剂的生产工艺由于要经过提取、浓缩、烘干等加工过程，无疑起到一定的杀菌作用，从而减少了微生物的污染。

综上所述，虽然同为内服给药制剂，但微生物污染水平结果差异显著，《中国兽药典》二OO五年版仅根据给药途径制订微生物限度控制标准已无法有效控制兽药卫生质量。

2  不同染菌量对健康动物的影响试验

2.1  材料与方法

2.1.1 材料

2.1.1.1培养基：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基、肉汤培养基和改良马丁培养基。

2.1.1.2试验菌：从中药黄连解毒散样品中分离细菌、霉菌，经纯化培养并进行菌落计数。

2.1.1.3试验鸡：山东省兽药质量检验所试验场饲养的13日龄健康海兰褐（公母兼有）500只，初始体重、遗传性相似。

2.1.1.4饲料、饮水：根据生长期要求，各试验组均在相同饲养条件下饲喂相同配方标准混合饲料；试验鸡饮用水源采用深井地下水作自备水源。同时采集饲料样本、水样检测细菌数、霉菌数。

2.1.2 方法

2.1.2.1试验用菌液的制备

2.1.2.1.1 药物中微生物的分离培养  无菌称取黄连解毒散10g于均质器中，加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。取灭菌试管4只，分别加入9ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。然后用1ml吸管吸取供试液加入9ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液试管中，混匀，依次稀释。分别取稀释后的1:10³、1:10⁴两个稀释级的供试液各1ml，分别加到直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基做两个平行。同时各做2个阴性对照。细菌于30-35℃培养48h，霉菌于23-28℃培养72h。

2.1.2.1.2 试验用菌增殖培养计数：将分离到的细菌和霉菌，分别接种到肉汤培养基和改良马丁培养基，进行增菌培养，细菌于35℃培养20h，霉菌于25℃培养48h。对菌液进行10倍递增稀释，按平皿表面活菌计数方法测得普通肉汤中含有细菌2.4×10⁸cfu/ml，改良马丁培养基中霉菌2×10⁸cfu/ml。

2.1.2.2 试验动物分组与处理  取13日龄健康海兰鸡500只,对试验用鸡进行空腹称重，淘汰体重差异较大的雏鸡，然后随机分为5组。除空白对照组外，其余各组通过饮水接种制备的菌液。以实际检测微生物限度结果(细菌数平均值：8.57×10⁵个/g；霉菌和酵母菌数平均值9.70×10³个/g)作为最低接种菌液参考剂量：细菌1×10⁶cfu/g、霉菌1×10⁴cfu/g，根据黄连解毒散用药剂量（0.1g/只/日），确定每只鸡每日接种菌数如表1。试验期为7d，停菌后继续观察3d。具体分组及处理见表1。

表1 试验鸡分组与处理

2.1.2.3按《中国兽药典》二OO五年版一部附录：微生物限度检查法对饮水、饲料进行细菌、霉菌计数，每种样品取1:10²、1:10³、1:10⁴三个稀释级的供试液。

2.1.2.4观察指标  各组同时开始添加试验菌，空白对照组，不添加菌液,各试验组均饲喂同一混合标准饲料。添菌饲喂停后，继续观察3日，各试验组鸡自由采食和饮水，每天注意观察鸡群的饮食、饮水、精神状态及粪便状态，记录死亡数。第11天试验各组鸡计数、称重，然后剖检，观察脏器病变。剖检死鸡，观察病变，确定死因。

2.1.2.5 结果统计 统计各组死亡率、增重，各组间进行t检验。

相对增重率＝加菌组或空白对照组的增重率÷空白对照组的增重率×100%

2.2  结果

2.2.1 临床症状  试验期间各组鸡精神状况、饮水和采食均未发现异常。

2.2.2剖检变化  试验结束后剖检各用菌液组及空白对照组鸡：心、肝、肾、肠道等均未发现异常（附解剖图）。

2.2.3 发病率与死亡率：试验期间各组鸡均未出现发病与死亡情况。

2.2.4增重情况：由表2可知，但各组间增重无显著性差异( P>0.05) 。

表2  各试验组鸡的增重情况

2.2.5 饲料样的细菌数3.7×10³cfu/ g，霉菌数1.3×10⁵cfu/g；水样细菌数＜10cfu/g，霉菌数＜10cfu/g。

2.3  讨论

本试验中各用菌组最低接种菌液剂量—细菌1×10⁶cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准1000倍）、霉菌1×10⁴cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准100倍）；最高剂量组—细菌5×10⁸cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准50 ,0000倍）、霉菌5×10⁶cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准50,000倍），并且饲料样细菌数、霉菌数分别是05版药典规定标准的3.7倍、1300倍。但是各用菌组试验鸡均未发现异常。试验表明微生物数量与其对动物的影响并无影响，分析认为动物的发病情况应与分离到的微生物致病性有直接关系。由此可见，兽药微生物限度标准的制定应该考虑到动物与人在各种因素上的差异，不可盲目的借鉴。

在我国的养殖条件下，畜禽的生长环境决定了大量的外来微生物必定被动物摄取。药物中的微生物数量相对于畜禽的生长环境的微生物数量来说，已经达到可以忽略的程度。此外，兽药微生物限度检查法存在操作性差，标准不集中,不统一，规范性有待统一和提高等问题。因此，对于兽药来说，微生物限度控制标准不应该照搬人药的指标和方案，应该在一定的临床研究基础上，科学合理的制定兽药微生物限度标准和方法，建立符合中国国情的评价兽药质量安全性标准。

3兽用制剂微生物污染对药品临床疗效的影响试验

3.1  试验材料

3.1.1试验药物  鸡康灵微粉，批号：20080502，规格：100g/袋，市售样品。

3.1.2对照药物  鸡康灵微粉，批号：20080502，采用⁶⁰Co-ɤ射线辐射灭菌，辐射剂量为25kGy。

3.1.2 试验动物  诸城市郝戈庄镇上茁山村养鸡户梁某的260日龄商品蛋鸡约3200羽。主诉：开始个别鸡流鼻涕、甩鼻、呼噜、咳嗽。曾用红霉素、恩诺沙星等药物治疗，但效果不好。10日后病鸡增多，症状加重，有部分鸡精精神沉郁，不愿走动，饮食减少，脸肿、眼肿、张口呼吸，产蛋率由90%降为82%。病鸡剖检变化为：气管内有少许粘液，鼻内、眶下窦有黄色干酪样物，胸腹部气囊混浊,严重呈现纤维素性炎,气囊壁增厚水肿，个别鸡出现心包炎、肝周炎；取鼻、气管分泌物、肺和气囊等组织进行MG分离培养，同时进行血清平板凝集试验确诊为鸡慢性呼吸道病（CRD）。

3.2 方法

3.2.1鸡康灵微粉的微生物限度检查 

3.2.2.1灭菌前的鸡康灵微粉的微生物限度检查   按照《中国兽药典》二OO五版二部附录：微生物限度检查法检验，结果表明：细菌数：1.67×10⁵cfu/g；霉菌和酵母菌数：4.3×10⁴cfu/g;大肠菌群＞10³cfu/g。

3.2.2.2 辐射灭菌后的鸡康灵微粉的微生物限度检查  检验方法同2.3.1, 结果表明：细菌数：＜10cfu/g；霉菌和酵母菌数：＜10cfu/g;大肠菌群阴性。

3.2.2试验分组及用药

    将供试鸡随机分为两组，每组1600只，第一组为鸡康灵微粉组，第二组为辐射灭菌后的鸡康灵微粉组。两组均按2g/kg饲料的剂量拌料给药，每天最后一次喂料时，将日用药量一次喂服，连用5-7天，停药后继续观察2周。

2.2.3 评价指标

试验前和试验结束后，每组随机抽取5%称重，根据发病率情况，治愈率、死亡率、相对增重率等指标，以鸡康灵微粉剂组(灭菌后)为对照，两组间进行X²检验，以评价鸡康灵微粉的疗效。

治愈率( %) = 治疗后痊愈鸡数÷试验鸡数×100

死亡率( %) = 治疗中死亡鸡数÷试验鸡数×100

相对增重率( %) = 试验鸡每只平均增重÷空白对照组平均每只鸡增重×100

3.2 结果与分析

3.2.1 两组用上述方法治疗5天后，治愈率均达90%以上，经X²检验，无显著性差异( P>0.05)，产蛋率均恢复到90%以上，结果见表1。

表3 鸡康灵微粉灭菌前后对鸡慢性呼吸道病的治疗结果统计

3.2.2 随着集约化养禽场的增多和规模化不断扩大，环境污染越加严重，其中不少病的病原广泛存在于养禽环境中，可通过多种途径传播，这些环境病原微生物已成为养禽场的常在菌。家禽的大规模化集约化饲养的密度过大、通风换气条件差，各种应激因素增多等不利因素，使得机体抵抗力降低，这些都直接导致了禽只对致病菌的易感性增强。另外，某些损害免疫系统的疾病如传染性法氏囊病、鸡传染性贫血等未能有效控制，使鸡只的免疫功能及抵抗力下降，也很容易引起细菌性疾病的发生。实际生产中继发感染、混合感染的病例上升，特别是一些条件性、环境性病原微生物所致的疾病。因此，只有通过科学的饲养管理，搞好环境卫生和合理用药才能有效控制细菌性疾病。

3.2.3 鸡康灵微粉由蒲公英、大青叶、板蓝根、金银花、黄芩等九味中药组成，应用超微粉碎技术(又称细胞级微粉碎技术)，使中药材的粉碎粒度达到200目以上，彻底打破纤维细胞壁，使有效成份充分溶出，通过细胞破壁提高原料药物的生物利用度，克服了普通粉碎工艺颗粒大，药物有效成份利用率低，疗效差的缺陷，对细菌性呼道疾病、肠道病有较好的疗效。

3.2.4 本试验表明鸡康灵微粉在灭菌前后疗效无显著差异，说明兽药制剂的微生物污染与兽药的临床疗效没有必然的相关性。

4 讨论与小结

4.1对山东省兽药GMP企业生产的粉散剂、预混剂、颗粒剂产品的微生物污染状况进行抽样调查检测，发现不同的内服给药制剂，其微生物污染水平结果差异显著；仅根据给药途径制订微生物限度控制标准无法有效控制兽药卫生质量。

4.2制订微生物限度控制标准主要目的之一是为了从源头上对产品的生产工艺、生产环境等生产环节的控制；但研究试验一表明：粉剂、预混剂、散剂、颗粒剂这同种不同剂型的微生物限度检查结果差异显著。影响微生物限度结果差异的因素大小依次为：药物本身抑菌活性＞ 制剂工艺＞生产环境。所以上述剂型微生物限度检验结果不能反映制剂的工艺控制水平与生产环境的优劣。

4.3 制订微生物限度控制标准主要目的之二是为了保证药物的疗效、保障动物的健康。但研究试验二表明：选择微生物限度严重超标的中药散剂，从中分离细菌、霉菌，拟定不同菌量的污染水平对健康鸡进行饲喂试验，结果：试验期间各用菌组试验鸡试验期间精神状况、饮水和采食均未发现异常，试验结束后剖检各用菌液组及空白对照组鸡的心、肝、肾、肠道等均未发现异常，各组鸡均未出现发病与死亡情况，且各组间增重无显著性差异( P>0.05)；研究试验三表明：选择鸡康灵微粉对自然感染鸡慢性呼吸道病进行治疗试验，结果：鸡康灵微粉在灭菌前后疗效无显著差异( P>0.05)。所以上述研究结果说明兽药制剂的微生物污染与动物的健康及药物本身的疗效没有必然的相关性。

综上所述，我们认为：一、应根据剂型制订兽药微生物限度标准；二、参照《中国药典》二OO五年版二部制剂通则项下要求微生物限度的剂型已经取消了对颗粒剂、片剂的微生物限度检查，应取消对固体兽用内服给药制剂（粉剂、预混剂、散剂、颗粒剂、片剂）的微生物限度检查。

2.2.2剖检变化  试验结束后剖检各用菌液组及空白对照组鸡：心、肝、肾、肠道等均未发现异常（附解剖图）。

2.2.3 发病率与死亡率：试验期间各组鸡均未出现发病与死亡情况。

2.2.4增重情况：由表2可知，但各组间增重无显著性差异( P>0.05) 。

表2  各试验组鸡的增重情况

2.2.5 饲料样的细菌数3.7×10³cfu/ g，霉菌数1.3×10⁵cfu/g；水样细菌数＜10cfu/g，霉菌数＜10cfu/g。

2.3  讨论

本试验中各用菌组最低接种菌液剂量—细菌1×10⁶cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准1000倍）、霉菌1×10⁴cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准100倍）；最高剂量组—细菌5×10⁸cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准50 ,0000倍）、霉菌5×10⁶cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准50,000倍），并且饲料样细菌数、霉菌数分别是05版药典规定标准的3.7倍、1300倍。但是各用菌组试验鸡均未发现异常。试验表明微生物数量与其对动物的影响并无影响，分析认为动物的发病情况应与分离到的微生物致病性有直接关系。由此可见，兽药微生物限度标准的制定应该考虑到动物与人在各种因素上的差异，不可盲目的借鉴。

在我国的养殖条件下，畜禽的生长环境决定了大量的外来微生物必定被动物摄取。药物中的微生物数量相对于畜禽的生长环境的微生物数量来说，已经达到可以忽略的程度。此外，兽药微生物限度检查法存在操作性差，标准不集中,不统一，规范性有待统一和提高等问题。因此，对于兽药来说，微生物限度控制标准不应该照搬人药的指标和方案，应该在一定的临床研究基础上，科学合理的制定兽药微生物限度标准和方法，建立符合中国国情的评价兽药质量安全性标准。

3兽用制剂微生物污染对药品临床疗效的影响试验

3.1  试验材料

3.1.1试验药物  鸡康灵微粉，批号：20080502，规格：100g/袋，市售样品。

3.1.2对照药物  鸡康灵微粉，批号：20080502，采用⁶⁰Co-ɤ射线辐射灭菌，辐射剂量为25kGy。

3.1.2 试验动物  诸城市郝戈庄镇上茁山村养鸡户梁某的260日龄商品蛋鸡约3200羽。主诉：开始个别鸡流鼻涕、甩鼻、呼噜、咳嗽。曾用红霉素、恩诺沙星等药物治疗，但效果不好。10日后病鸡增多，症状加重，有部分鸡精精神沉郁，不愿走动，饮食减少，脸肿、眼肿、张口呼吸，产蛋率由90%降为82%。病鸡剖检变化为：气管内有少许粘液，鼻内、眶下窦有黄色干酪样物，胸腹部气囊混浊,严重呈现纤维素性炎,气囊壁增厚水肿，个别鸡出现心包炎、肝周炎；取鼻、气管分泌物、肺和气囊等组织进行MG分离培养，同时进行血清平板凝集试验确诊为鸡慢性呼吸道病（CRD）。

3.2 方法

3.2.1鸡康灵微粉的微生物限度检查 

3.2.2.1灭菌前的鸡康灵微粉的微生物限度检查   按照《中国兽药典》二OO五版二部附录：微生物限度检查法检验，结果表明：细菌数：1.67×10⁵cfu/g；霉菌和酵母菌数：4.3×10⁴cfu/g;大肠菌群＞10³cfu/g。

3.2.2.2 辐射灭菌后的鸡康灵微粉的微生物限度检查  检验方法同2.3.1, 结果表明：细菌数：＜10cfu/g；霉菌和酵母菌数：＜10cfu/g;大肠菌群阴性。

3.2.2试验分组及用药

    将供试鸡随机分为两组，每组1600只，第一组为鸡康灵微粉组，第二组为辐射灭菌后的鸡康灵微粉组。两组均按2g/kg饲料的剂量拌料给药，每天最后一次喂料时，将日用药量一次喂服，连用5-7天，停药后继续观察2周。

2.2.3 评价指标

试验前和试验结束后，每组随机抽取5%称重，根据发病率情况，治愈率、死亡率、相对增重率等指标，以鸡康灵微粉剂组(灭菌后)为对照，两组间进行X²检验，以评价鸡康灵微粉的疗效。

治愈率( %) = 治疗后痊愈鸡数÷试验鸡数×100

死亡率( %) = 治疗中死亡鸡数÷试验鸡数×100

相对增重率( %) = 试验鸡每只平均增重÷空白对照组平均每只鸡增重×100

3.2 结果与分析

3.2.1 两组用上述方法治疗5天后，治愈率均达90%以上，经X²检验，无显著性差异( P>0.05)，产蛋率均恢复到90%以上，结果见表1。

表3 鸡康灵微粉灭菌前后对鸡慢性呼吸道病的治疗结果统计

3.2.2 随着集约化养禽场的增多和规模化不断扩大，环境污染越加严重，其中不少病的病原广泛存在于养禽环境中，可通过多种途径传播，这些环境病原微生物已成为养禽场的常在菌。家禽的大规模化集约化饲养的密度过大、通风换气条件差，各种应激因素增多等不利因素，使得机体抵抗力降低，这些都直接导致了禽只对致病菌的易感性增强。另外，某些损害免疫系统的疾病如传染性法氏囊病、鸡传染性贫血等未能有效控制，使鸡只的免疫功能及抵抗力下降，也很容易引起细菌性疾病的发生。实际生产中继发感染、混合感染的病例上升，特别是一些条件性、环境性病原微生物所致的疾病。因此，只有通过科学的饲养管理，搞好环境卫生和合理用药才能有效控制细菌性疾病。

3.2.3 鸡康灵微粉由蒲公英、大青叶、板蓝根、金银花、黄芩等九味中药组成，应用超微粉碎技术(又称细胞级微粉碎技术)，使中药材的粉碎粒度达到200目以上，彻底打破纤维细胞壁，使有效成份充分溶出，通过细胞破壁提高原料药物的生物利用度，克服了普通粉碎工艺颗粒大，药物有效成份利用率低，疗效差的缺陷，对细菌性呼道疾病、肠道病有较好的疗效。

3.2.4 本试验表明鸡康灵微粉在灭菌前后疗效无显著差异，说明兽药制剂的微生物污染与兽药的临床疗效没有必然的相关性。

4 讨论与小结

4.1对山东省兽药GMP企业生产的粉散剂、预混剂、颗粒剂产品的微生物污染状况进行抽样调查检测，发现不同的内服给药制剂，其微生物污染水平结果差异显著；仅根据给药途径制订微生物限度控制标准无法有效控制兽药卫生质量。

4.2制订微生物限度控制标准主要目的之一是为了从源头上对产品的生产工艺、生产环境等生产环节的控制；但研究试验一表明：粉剂、预混剂、散剂、颗粒剂这同种不同剂型的微生物限度检查结果差异显著。影响微生物限度结果差异的因素大小依次为：药物本身抑菌活性＞ 制剂工艺＞生产环境。所以上述剂型微生物限度检验结果不能反映制剂的工艺控制水平与生产环境的优劣。

4.3 制订微生物限度控制标准主要目的之二是为了保证药物的疗效、保障动物的健康。但研究试验二表明：选择微生物限度严重超标的中药散剂，从中分离细菌、霉菌，拟定不同菌量的污染水平对健康鸡进行饲喂试验，结果：试验期间各用菌组试验鸡试验期间精神状况、饮水和采食均未发现异常，试验结束后剖检各用菌液组及空白对照组鸡的心、肝、肾、肠道等均未发现异常，各组鸡均未出现发病与死亡情况，且各组间增重无显著性差异( P>0.05)；研究试验三表明：选择鸡康灵微粉对自然感染鸡慢性呼吸道病进行治疗试验，结果：鸡康灵微粉在灭菌前后疗效无显著差异( P>0.05)。所以上述研究结果说明兽药制剂的微生物污染与动物的健康及药物本身的疗效没有必然的相关性。

综上所述，我们认为：一、应根据剂型制订兽药微生物限度标准；二、参照《中国药典》二OO五年版二部制剂通则项下要求微生物限度的剂型已经取消了对颗粒剂、片剂的微生物限度检查，应取消对固体兽用内服给药制剂（粉剂、预混剂、散剂、颗粒剂、片剂）的微生物限度检查。

2.2.2剖检变化  试验结束后剖检各用菌液组及空白对照组鸡：心、肝、肾、肠道等均未发现异常（附解剖图）。

2.2.3 发病率与死亡率：试验期间各组鸡均未出现发病与死亡情况。

2.2.4增重情况：由表2可知，但各组间增重无显著性差异( P>0.05) 。

表2  各试验组鸡的增重情况

2.2.5 饲料样的细菌数3.7×10³cfu/ g，霉菌数1.3×10⁵cfu/g；水样细菌数＜10cfu/g，霉菌数＜10cfu/g。

2.3  讨论

本试验中各用菌组最低接种菌液剂量—细菌1×10⁶cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准1000倍）、霉菌1×10⁴cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准100倍）；最高剂量组—细菌5×10⁸cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准50 ,0000倍）、霉菌5×10⁶cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准50,000倍），并且饲料样细菌数、霉菌数分别是05版药典规定标准的3.7倍、1300倍。但是各用菌组试验鸡均未发现异常。试验表明微生物数量与其对动物的影响并无影响，分析认为动物的发病情况应与分离到的微生物致病性有直接关系。由此可见，兽药微生物限度标准的制定应该考虑到动物与人在各种因素上的差异，不可盲目的借鉴。

在我国的养殖条件下，畜禽的生长环境决定了大量的外来微生物必定被动物摄取。药物中的微生物数量相对于畜禽的生长环境的微生物数量来说，已经达到可以忽略的程度。此外，兽药微生物限度检查法存在操作性差，标准不集中,不统一，规范性有待统一和提高等问题。因此，对于兽药来说，微生物限度控制标准不应该照搬人药的指标和方案，应该在一定的临床研究基础上，科学合理的制定兽药微生物限度标准和方法，建立符合中国国情的评价兽药质量安全性标准。

3兽用制剂微生物污染对药品临床疗效的影响试验

3.1  试验材料

3.1.1试验药物  鸡康灵微粉，批号：20080502，规格：100g/袋，市售样品。

3.1.2对照药物  鸡康灵微粉，批号：20080502，采用⁶⁰Co-ɤ射线辐射灭菌，辐射剂量为25kGy。

3.1.2 试验动物  诸城市郝戈庄镇上茁山村养鸡户梁某的260日龄商品蛋鸡约3200羽。主诉：开始个别鸡流鼻涕、甩鼻、呼噜、咳嗽。曾用红霉素、恩诺沙星等药物治疗，但效果不好。10日后病鸡增多，症状加重，有部分鸡精精神沉郁，不愿走动，饮食减少，脸肿、眼肿、张口呼吸，产蛋率由90%降为82%。病鸡剖检变化为：气管内有少许粘液，鼻内、眶下窦有黄色干酪样物，胸腹部气囊混浊,严重呈现纤维素性炎,气囊壁增厚水肿，个别鸡出现心包炎、肝周炎；取鼻、气管分泌物、肺和气囊等组织进行MG分离培养，同时进行血清平板凝集试验确诊为鸡慢性呼吸道病（CRD）。

3.2 方法

3.2.1鸡康灵微粉的微生物限度检查 

3.2.2.1灭菌前的鸡康灵微粉的微生物限度检查   按照《中国兽药典》二OO五版二部附录：微生物限度检查法检验，结果表明：细菌数：1.67×10⁵cfu/g；霉菌和酵母菌数：4.3×10⁴cfu/g;大肠菌群＞10³cfu/g。

3.2.2.2 辐射灭菌后的鸡康灵微粉的微生物限度检查  检验方法同2.3.1, 结果表明：细菌数：＜10cfu/g；霉菌和酵母菌数：＜10cfu/g;大肠菌群阴性。

3.2.2试验分组及用药

    将供试鸡随机分为两组，每组1600只，第一组为鸡康灵微粉组，第二组为辐射灭菌后的鸡康灵微粉组。两组均按2g/kg饲料的剂量拌料给药，每天最后一次喂料时，将日用药量一次喂服，连用5-7天，停药后继续观察2周。

2.2.3 评价指标

试验前和试验结束后，每组随机抽取5%称重，根据发病率情况，治愈率、死亡率、相对增重率等指标，以鸡康灵微粉剂组(灭菌后)为对照，两组间进行X²检验，以评价鸡康灵微粉的疗效。

治愈率( %) = 治疗后痊愈鸡数÷试验鸡数×100

死亡率( %) = 治疗中死亡鸡数÷试验鸡数×100

相对增重率( %) = 试验鸡每只平均增重÷空白对照组平均每只鸡增重×100

3.2 结果与分析

3.2.1 两组用上述方法治疗5天后，治愈率均达90%以上，经X²检验，无显著性差异( P>0.05)，产蛋率均恢复到90%以上，结果见表1。

表3 鸡康灵微粉灭菌前后对鸡慢性呼吸道病的治疗结果统计

3.2.2 随着集约化养禽场的增多和规模化不断扩大，环境污染越加严重，其中不少病的病原广泛存在于养禽环境中，可通过多种途径传播，这些环境病原微生物已成为养禽场的常在菌。家禽的大规模化集约化饲养的密度过大、通风换气条件差，各种应激因素增多等不利因素，使得机体抵抗力降低，这些都直接导致了禽只对致病菌的易感性增强。另外，某些损害免疫系统的疾病如传染性法氏囊病、鸡传染性贫血等未能有效控制，使鸡只的免疫功能及抵抗力下降，也很容易引起细菌性疾病的发生。实际生产中继发感染、混合感染的病例上升，特别是一些条件性、环境性病原微生物所致的疾病。因此，只有通过科学的饲养管理，搞好环境卫生和合理用药才能有效控制细菌性疾病。

3.2.3 鸡康灵微粉由蒲公英、大青叶、板蓝根、金银花、黄芩等九味中药组成，应用超微粉碎技术(又称细胞级微粉碎技术)，使中药材的粉碎粒度达到200目以上，彻底打破纤维细胞壁，使有效成份充分溶出，通过细胞破壁提高原料药物的生物利用度，克服了普通粉碎工艺颗粒大，药物有效成份利用率低，疗效差的缺陷，对细菌性呼道疾病、肠道病有较好的疗效。

3.2.4 本试验表明鸡康灵微粉在灭菌前后疗效无显著差异，说明兽药制剂的微生物污染与兽药的临床疗效没有必然的相关性。

4 讨论与小结

4.1对山东省兽药GMP企业生产的粉散剂、预混剂、颗粒剂产品的微生物污染状况进行抽样调查检测，发现不同的内服给药制剂，其微生物污染水平结果差异显著；仅根据给药途径制订微生物限度控制标准无法有效控制兽药卫生质量。

4.2制订微生物限度控制标准主要目的之一是为了从源头上对产品的生产工艺、生产环境等生产环节的控制；但研究试验一表明：粉剂、预混剂、散剂、颗粒剂这同种不同剂型的微生物限度检查结果差异显著。影响微生物限度结果差异的因素大小依次为：药物本身抑菌活性＞ 制剂工艺＞生产环境。所以上述剂型微生物限度检验结果不能反映制剂的工艺控制水平与生产环境的优劣。

4.3 制订微生物限度控制标准主要目的之二是为了保证药物的疗效、保障动物的健康。但研究试验二表明：选择微生物限度严重超标的中药散剂，从中分离细菌、霉菌，拟定不同菌量的污染水平对健康鸡进行饲喂试验，结果：试验期间各用菌组试验鸡试验期间精神状况、饮水和采食均未发现异常，试验结束后剖检各用菌液组及空白对照组鸡的心、肝、肾、肠道等均未发现异常，各组鸡均未出现发病与死亡情况，且各组间增重无显著性差异( P>0.05)；研究试验三表明：选择鸡康灵微粉对自然感染鸡慢性呼吸道病进行治疗试验，结果：鸡康灵微粉在灭菌前后疗效无显著差异( P>0.05)。所以上述研究结果说明兽药制剂的微生物污染与动物的健康及药物本身的疗效没有必然的相关性。

综上所述，我们认为：一、应根据剂型制订兽药微生物限度标准；二、参照《中国药典》二OO五年版二部制剂通则项下要求微生物限度的剂型已经取消了对颗粒剂、片剂的微生物限度检查，应取消对固体兽用内服给药制剂（粉剂、预混剂、散剂、颗粒剂、片剂）的微生物限度检查。

2.2.2剖检变化  试验结束后剖检各用菌液组及空白对照组鸡：心、肝、肾、肠道等均未发现异常（附解剖图）。

2.2.3 发病率与死亡率：试验期间各组鸡均未出现发病与死亡情况。

2.2.4增重情况：由表2可知，但各组间增重无显著性差异( P>0.05) 。

表2  各试验组鸡的增重情况

2.2.5 饲料样的细菌数3.7×10³cfu/ g，霉菌数1.3×10⁵cfu/g；水样细菌数＜10cfu/g，霉菌数＜10cfu/g。

2.3  讨论

本试验中各用菌组最低接种菌液剂量—细菌1×10⁶cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准1000倍）、霉菌1×10⁴cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准100倍）；最高剂量组—细菌5×10⁸cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准50 ,0000倍）、霉菌5×10⁶cfu/g（为《中国兽药典》二OO五年版一部规定标准50,000倍），并且饲料样细菌数、霉菌数分别是05版药典规定标准的3.7倍、1300倍。但是各用菌组试验鸡均未发现异常。试验表明微生物数量与其对动物的影响并无影响，分析认为动物的发病情况应与分离到的微生物致病性有直接关系。由此可见，兽药微生物限度标准的制定应该考虑到动物与人在各种因素上的差异，不可盲目的借鉴。

在我国的养殖条件下，畜禽的生长环境决定了大量的外来微生物必定被动物摄取。药物中的微生物数量相对于畜禽的生长环境的微生物数量来说，已经达到可以忽略的程度。此外，兽药微生物限度检查法存在操作性差，标准不集中,不统一，规范性有待统一和提高等问题。因此，对于兽药来说，微生物限度控制标准不应该照搬人药的指标和方案，应该在一定的临床研究基础上，科学合理的制定兽药微生物限度标准和方法，建立符合中国国情的评价兽药质量安全性标准。

3兽用制剂微生物污染对药品临床疗效的影响试验

3.1  试验材料

3.1.1试验药物  鸡康灵微粉，批号：20080502，规格：100g/袋，市售样品。

3.1.2对照药物  鸡康灵微粉，批号：20080502，采用⁶⁰Co-ɤ射线辐射灭菌，辐射剂量为25kGy。

3.1.2 试验动物  诸城市郝戈庄镇上茁山村养鸡户梁某的260日龄商品蛋鸡约3200羽。主诉：开始个别鸡流鼻涕、甩鼻、呼噜、咳嗽。曾用红霉素、恩诺沙星等药物治疗，但效果不好。10日后病鸡增多，症状加重，有部分鸡精精神沉郁，不愿走动，饮食减少，脸肿、眼肿、张口呼吸，产蛋率由90%降为82%。病鸡剖检变化为：气管内有少许粘液，鼻内、眶下窦有黄色干酪样物，胸腹部气囊混浊,严重呈现纤维素性炎,气囊壁增厚水肿，个别鸡出现心包炎、肝周炎；取鼻、气管分泌物、肺和气囊等组织进行MG分离培养，同时进行血清平板凝集试验确诊为鸡慢性呼吸道病（CRD）。

3.2 方法

3.2.1鸡康灵微粉的微生物限度检查 

3.2.2.1灭菌前的鸡康灵微粉的微生物限度检查   按照《中国兽药典》二OO五版二部附录：微生物限度检查法检验，结果表明：细菌数：1.67×10⁵cfu/g；霉菌和酵母菌数：4.3×10⁴cfu/g;大肠菌群＞10³cfu/g。

3.2.2.2 辐射灭菌后的鸡康灵微粉的微生物限度检查  检验方法同2.3.1, 结果表明：细菌数：＜10cfu/g；霉菌和酵母菌数：＜10cfu/g;大肠菌群阴性。

3.2.2试验分组及用药

    将供试鸡随机分为两组，每组1600只，第一组为鸡康灵微粉组，第二组为辐射灭菌后的鸡康灵微粉组。两组均按2g/kg饲料的剂量拌料给药，每天最后一次喂料时，将日用药量一次喂服，连用5-7天，停药后继续观察2周。

2.2.3 评价指标

试验前和试验结束后，每组随机抽取5%称重，根据发病率情况，治愈率、死亡率、相对增重率等指标，以鸡康灵微粉剂组(灭菌后)为对照，两组间进行X²检验，以评价鸡康灵微粉的疗效。

治愈率( %) = 治疗后痊愈鸡数÷试验鸡数×100

死亡率( %) = 治疗中死亡鸡数÷试验鸡数×100

相对增重率( %) = 试验鸡每只平均增重÷空白对照组平均每只鸡增重×100

3.2 结果与分析

3.2.1 两组用上述方法治疗5天后，治愈率均达90%以上，经X²检验，无显著性差异( P>0.05)，产蛋率均恢复到90%以上，结果见表1。

表3 鸡康灵微粉灭菌前后对鸡慢性呼吸道病的治疗结果统计

3.2.2 随着集约化养禽场的增多和规模化不断扩大，环境污染越加严重，其中不少病的病原广泛存在于养禽环境中，可通过多种途径传播，这些环境病原微生物已成为养禽场的常在菌。家禽的大规模化集约化饲养的密度过大、通风换气条件差，各种应激因素增多等不利因素，使得机体抵抗力降低，这些都直接导致了禽只对致病菌的易感性增强。另外，某些损害免疫系统的疾病如传染性法氏囊病、鸡传染性贫血等未能有效控制，使鸡只的免疫功能及抵抗力下降，也很容易引起细菌性疾病的发生。实际生产中继发感染、混合感染的病例上升，特别是一些条件性、环境性病原微生物所致的疾病。因此，只有通过科学的饲养管理，搞好环境卫生和合理用药才能有效控制细菌性疾病。

3.2.3 鸡康灵微粉由蒲公英、大青叶、板蓝根、金银花、黄芩等九味中药组成，应用超微粉碎技术(又称细胞级微粉碎技术)，使中药材的粉碎粒度达到200目以上，彻底打破纤维细胞壁，使有效成份充分溶出，通过细胞破壁提高原料药物的生物利用度，克服了普通粉碎工艺颗粒大，药物有效成份利用率低，疗效差的缺陷，对细菌性呼道疾病、肠道病有较好的疗效。

3.2.4 本试验表明鸡康灵微粉在灭菌前后疗效无显著差异，说明兽药制剂的微生物污染与兽药的临床疗效没有必然的相关性。

4 讨论与小结

4.1对山东省兽药GMP企业生产的粉散剂、预混剂、颗粒剂产品的微生物污染状况进行抽样调查检测，发现不同的内服给药制剂，其微生物污染水平结果差异显著；仅根据给药途径制订微生物限度控制标准无法有效控制兽药卫生质量。

4.2制订微生物限度控制标准主要目的之一是为了从源头上对产品的生产工艺、生产环境等生产环节的控制；但研究试验一表明：粉剂、预混剂、散剂、颗粒剂这同种不同剂型的微生物限度检查结果差异显著。影响微生物限度结果差异的因素大小依次为：药物本身抑菌活性＞ 制剂工艺＞生产环境。所以上述剂型微生物限度检验结果不能反映制剂的工艺控制水平与生产环境的优劣。

4.3 制订微生物限度控制标准主要目的之二是为了保证药物的疗效、保障动物的健康。但研究试验二表明：选择微生物限度严重超标的中药散剂，从中分离细菌、霉菌，拟定不同菌量的污染水平对健康鸡进行饲喂试验，结果：试验期间各用菌组试验鸡试验期间精神状况、饮水和采食均未发现异常，试验结束后剖检各用菌液组及空白对照组鸡的心、肝、肾、肠道等均未发现异常，各组鸡均未出现发病与死亡情况，且各组间增重无显著性差异( P>0.05)；研究试验三表明：选择鸡康灵微粉对自然感染鸡慢性呼吸道病进行治疗试验，结果：鸡康灵微粉在灭菌前后疗效无显著差异( P>0.05)。所以上述研究结果说明兽药制剂的微生物污染与动物的健康及药物本身的疗效没有必然的相关性。

综上所述，我们认为：一、应根据剂型制订兽药微生物限度标准；二、参照《中国药典》二OO五年版二部制剂通则项下要求微生物限度的剂型已经取消了对颗粒剂、片剂的微生物限度检查，应取消对固体兽用内服给药制剂（粉剂、预混剂、散剂、颗粒剂、片剂）的微生物限度检查。